Эмбрионы, гены и эволюция - Рудольф Рэфф

Рис. 11-2. Зависимость значений C0t1/2 от количества ДНК во фракции уникальных последовательностей для геномов разных животных. (Данные по фагу Т4, Е. coli и теленку - Britten, Kohne, 1968; по дрожжам - Hereford, Rosbash, 1977; по морскому ежу - Angerer et al., 1976; по Aplesia (моллюск) - Angerer et al., 1975; по дрозофиле - Davidson et al., 1975; Manning et al., 1975.)

Рис. 11-3. Кинетика реассоциации ДНК для геномов бактерий и эукариот. Геном Escherichia coli состоит почти исключительно из уникальных копий, и его реассоциация описывается одной кривой второго порядка. Геном теленка содержит как повторяющиеся последовательности, которые быстро ренатурируют (при низких значениях C0t), так и уникальные последовательности, которые ренатурируют медленно (Britten, Kohne, 1968).

Большинство структурных генов представляют собой уникальные последовательности, но нередко значительную часть геномов эукариот составляют повторяющиеся последовательности. Например, ДНК Xenopus, весьма типичная для Metazoa, содержит 54% уникальных последовательностей; 10% всей ДНК составляли семейства последовательностей, каждая из которых повторяется примерно по 100 раз, 31% - по 2000 раз и примерно 5% - свыше 105 раз. Число семейств повторяющихся последовательностей очень велико: у Xenopus последовательности, повторяющиеся по 100 раз, распадаются на 18 000 различных семейств.

Члены данного семейства повторяющихся последовательностей близки, но не обязательно идентичны. Степень дивергенции между членами различна для разных семейств, как это показали Клейн и др. (Klein et al.). Геномы морских ежей, подобно геномам других эукариот, содержат несколько тысяч семейств повторяющихся последовательностей. Клейн и его сотрудники изучали клоны рекомбинантной ДНК представителей 18 различных семейств последовательностей, в которых число повторяющихся членов колебалось от 3 до 12500. Эти клоны гибридизовали с геномной ДНК и определяли стабильность гибридов в качестве теста на дивергенцию. У трех клонов дивергенция оказалась очень слабой, у семи - умеренной, а у восьми дивергенция в пределах их семейств оказалась очень сильной. Новые семейства повторяющихся последовательностей возникают, по-видимому, в результате внезапной репликации предсуществующей последовательности. Дивергенция членов данного семейства происходит путем замены нуклеотидов у отдельных членов, а степень дивергенции предположительно отражает возраст данного семейства. Мур и др. (Moore et al.) подвергли проверке эту гипотезу, используя клоны семейств повторяющихся последовательностей, выделенные из морского ежа Strongylocentrotus purpuratus. С помощью этих клонов измеряли величину соответствующих семейств последовательностей у S. purpuratus, S. franciscanus и Lytechinus pictus. По данным Дархема (Durham), два вида Strongylocentrotus разошлись около 10-20 млн. лет назад, а роды Strongylocentrotus и Lytechinus - 150-200 млн. лет назад. У отмеченных трех видов были найдены очень близкие семейства последовательностей, различавшиеся, однако, по частоте повторов. Так, например, у S. purpuratus одно семейство содержало 800 членов, у S. franciscanus - 80, а у L. pictus - только 8. Поскольку близкие семейства повторяющихся последовательностей обнаружены у видов, дивергировавших еще 150-200 млн. лет назад, эти семейства следует считать очень древними. Кроме того, в процессе эволюции различных видов в этих семействах, по-видимому, возникали независимые скачкообразные репликации, подобно возникновению повторяющихся последовательностей у приматов (см. рис. 3-2).

Семейства наиболее высокоповторяющихся последовательностей содержат миллионы копий, и их последовательности организованы довольно просто: основная единица состоит примерно из 10 тандемно повторяющихся нуклеотидных пар. Эти сателлитные ДНК, которые могут составлять до 40% генома, образуют кластеры в эукариотических хромосомах. Они обычно не транскрибируются и, по-видимому, обеспечивают лишь надлежащую организацию хромосом. Менее высокоповторяющиеся последовательности, которые мы обсуждаем, организованы совершенно иначе. Дэвидсон (Davidson) и его сотрудники впервые показали, что у Xenopus члены семейств умеренно-повторяющихся последовательностей разбросаны по всему геному между уникальными последовательностями. Длина повторяющихся последовательностей у этой лягушки соответствует в среднем 300 парам нуклеотидов, а длина уникальных последовательностей колеблется от 800 до 4000 пар. Как установлено рядом исследователей (литературу см. Levin 1980), подобная структура из «коротких повторов» часто встречается у таких различных организмов, как миксомицеты, высшие растения, медузы, двустворчатые моллюски, морские ежи и человек. Маннинг и др. (Manning et al.) обнаружили совершенно иной тип организации из «длинных повторов» у дрозофилы, у которой последовательности из 5600 нуклеотидных пар чередуются с уникальными последовательностями из более чем 13 000 пар. Сходную структуру из длинных последовательностей описали Крейн и др. (Grain et al.) для ДНК пчелы, однако такая организация генома свойственна не всем насекомым, так как у комнатной мухи (Diptera) обнаружена структура типа коротких повторов. У некоторых грибов и нематод «вкрапления» повторяющихся последовательностей, по-видимому, отсутствуют; это заставляет думать, что роли, приписываемые таким повторам на основе изучения высших Metazoa, возможно, свойственны не всем организмам.

Существование повторяющихся последовательностей между генами, состоящими из уникальных последовательностей, представляет значительный интерес, потому что они, возможно, обеспечивают интеграцию экспрессии уникальных генов. Модели Бриттена и Дэвидсона (Britten, Davidson) рассматриваются в гл. 12, но здесь о них следует упомянуть, потому что они были побудительной причиной большинства исследований, посвященных повторяющимся последовательностям. Эти модели были созданы для того, чтобы объяснить чрезвычайную стабильность и четкую определенность характера экспрессии структурных генов, наблюдаемую в дифференцированных тканях. Согласно этим моделям, комплекс структурных генов, экспрессирующихся в той или иной ткани, представляет собой «батарею» генов. Гены, экспрессируемые в такой батарее, не сцеплены физически; напротив, у эукариот они рассеяны по геному. Интеграция достигается при помощи сетки регулирующих последовательностей, с тем чтобы последовательности, примыкающие к комплексу структурных генов с уникальными последовательностями, могли распознавать некую общую интегрирующую последовательность. Эти примыкающие последовательности неизбежно должны быть повторяющимися.

Для того чтобы повторяющиеся последовательности могли нести интегративные функции, необходимо, чтобы они были расположены вперемежку со структурными генами, подвергались транскрипции и чтобы в разных тканях транскрипция повторяющихся последовательностей протекала по-разному, потому что разные типы структурных генов должны в конечном счете экспрессироваться в виде мРНК. Эти требования, по-видимому, удовлетворяются. Тот факт, что структурные гены, регулируемые в процессе развития, и повторяющиеся последовательности тесно перемешаны, установлен для генов β-глобинов. Шен и Маниатис (Shen, Maniatis) исследовали участок генома кролика длиной в 44 000 нуклеотидных пар, который содержит кластер из четырех генов β-глобина. Было обнаружено, что гены этой группы перемежаются с 20 различными повторяющимися последовательностями, распадающимися на 5 семейств. Оказалось, что к каждому глобиновому гену примыкает по бокам по крайней мере одна пара инвертированных повторов длиной в 140-400 пар нуклеотидов, а весь генный кластер фланкирован парой более длинных (1400 нуклеотидных пар) повторяющихся последовательностей, ориентированных в противоположных направлениях по отношению одна к другой (обращенных повторов).

Транскрипция умеренно-повторяющихся последовательностей была продемонстрирована у зародышей морских ежей. Шеллер и др. (Scheller et al.) использовали ряд клонов отдельных членов нескольких семейств повторяющихся последовательностей для того, чтобы сравнить экспрессию транскриптов этих семейств в ядрах клеток зародыша на стадии гаструлы и клеток кишечника взрослого животного. Число копий в изученных семействах повторяющихся последовательностей колебалось от 20 до 1000 на геном; члены одних семейств были очень консервативны, т. е. их последовательности оставались в процессе эволюции неизменными, тогда как у членов других семейств они сильно дивергировали. В ядрах тех и других клеток были обнаружены транскрипты всех последовательностей, однако они четко различались в отличие от транскриптов уникальных последовательностей, которые очень сходны в ядрах как клеток гаструлы, так и клеток кишечника. Подобным же образом Константини и др. (Constantini et al.) обнаружили, что члены по крайней мере 80% семейств повторяющихся последовательностей из генома морского ежа представлены в РНК яиц. Самое интригующее наблюдение этих авторов состоит в том, что (в отличие от структурных генов) транскрипты обеих цепей повторяющихся последовательностей присутствуют в ядрах в виде копий РНК. В цитоплазме яиц обнаружены также транскрипты повторяющихся последовательностей, связанные с РНК, подобными матричным. Хотя присутствие транскриптов обеих цепей повторяющихся последовательностей и неожиданно, оно совместимо с гипотезой регуляции, при которой регуляторный транскрипт должен связаться с комплементарной ему, состоящей из повторяющихся последовательностей частью транскрипта, подлежащего процессингу. Следует помнить, однако, что совместимость - это еще не доказательство: может оказаться, что повторяющиеся последовательности несут совершенно иные функции. Например, Джелинек и др. (Jelinek et al.) изучали главное семейство коротких повторов в геноме человека - семейство Alu, присутствующее в геноме в нескольких сотнях тысяч сайтов. Эти последовательности транскрибируются с образованием ядерной РНК; неясно, однако, выполняют ли они какую-то функцию, существенную для ядерной РНК, или же эта их транскрипция - случайное следствие их функции или локализации в ДНК. Существует еще один класс повторяющихся последовательностей, который, как может оказаться, играет значительную роль в регуляции генной экспрессии в процессе развития, а также в эволюционных изменениях генной организации. Это подвижные элементы, представляющие собой длинные последовательности с короткими прямыми повторами на каждом конце. Эти последовательности, которые включены в молекулу ДНК в ряде сайтов, могут вырезаться и переноситься на другое место в пределах данного генома. Такие элементы впервые обнаружила генетическими методами Мак-Клинток (McClintock) в 50-х годах у кукурузы, но их молекулярная природа была выявлена лишь недавно. Функция этих элементов неясна, однако, включаясь рядом с 5'-концом структурных генов, они могут действовать как регуляторные элементы, активируя эти гены. Как показали Эрреде и др. (Errede et al.) и Уильямсон и, др. (Williamson et al.), один из таких элементов - последовательность Ty1 дрожжей-действует именно подобным образом. Работа Эрреде и др. представляет особый интерес, потому что гены, активируемые в результате включения примыкающего к ним элемента Ty1, приобретают способность реагировать на контролирующее воздействие аллелей, которые, определяя тип скрещивания, регулируют конъюгацию и споруляцию у дрожжей. Возможно, что эти подвижные элементы обеспечивают механизм, контролирующий генную экспрессию в процессе развития при помощи регулируемой модификации генома, однако такую их функцию еще следует продемонстрировать. Быть может, гораздо более важную роль подвижные элементы играют в эволюции, потому что они обладают способностью перемещать контролирующие элементы на новые места, тем самым добавляя гены к определенным контролирующим сетям или удаляя их из таких сетей. Сходные элементы были обнаружены у дрозофилы и у мыши.