Интернет-журнал 'Домашняя лаборатория', 2007 №5 - Федорочев
Шрифт:
Интервал:
Закладка:
Гаплоиды получают, используя гаплопродюссеры (отдаленную гибридизацию), партеногенез. Гаплоиды можно получить в культуре тканей из пыльников и клеток зародышевого мешка, гаплоиды в культуре тканей уже получены у 200 видов растений.
Для большинства растений оптимальным сроком посадки пыльников на питательные среды является стадия "средних" или "поздних" одноядерных вакуолизированных микроспор. На этой стадии микроспоры высвобождаются из тетрад и готовятся к первому митозу.
Для культивирования пыльников используют среды: Мурасиге-Скуга с 1/2 концентрацией солей, китайские среды, среды с картофельным экстрактом, среду Нич. Ауксины либо вообще не добавляют, либо используют 2,4-Д. Из цитокининов применяют кинетин и 6-БАП. Агар-агар тщательно промывают, так как он содержит вещества неблагоприятно влияющие на развитие пыльников. Для адсорбции метаболитов ингибирующих ростовые процессы в культуре тканей в питательные среды добавляют активированный уголь.
Перед культивированием пыльники выдерживают при температуре 4–6 °C в течение 2–8 суток. Изолированные пыльники культивируют либо в темноте, либо при слабом освещении при температуре 25 + 2 °C.
На питательных средах микроспора может образовать каллус или гаплоидный зародыш (сначала образуется 40-50-клеточный проэмбрио). Зародыш в глобулярной стадии разрывает экзину и проходит стадии, аналогичные развитию зиготического зародыша. Пыльца делится, клетки увеличиваются, экзина разрывается и образуется каллус, на котором, варьируя соотношение фитогормонов, можно получить гаплоидные эмбриоиды. Получение гаплоидов биотехнологическими методами позволяет быстро создавать гомозиготные линии, что делает данную технологию весьма ценной для селекции и генетики.
В процессе культивирования изолированных пыльников на питательных средах развитие идет двумя путями: либо прямым андрогенезом (образованием эмбриоидов и гаплоидных растений-регенерантов), либо косвенным андрогенезом, когда репродуктивные клетки дедифференцируются и переходят к пролиферации, образуя сначала каллус, а затем при пассировании на специальные среды — морфогенный каллус и регенеранты.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, бутоны вишни и яблони, пробирки со средою для каллусогенеза, препарировальные иглы, пинцеты, флакон с 96 % спиртом, 6 % раствор хлорамина, вата, фольга.
Ход работы.
1. Бутоны стерилизуют в 6 % растворе хлорамина 10 минут, для этого поместить бутоны в марлевый мешочек по 20 штук в каждый и опустить в стакан со стерилизующим раствором, затем тщательно промыть бутоны (5–6 раз) стерильной дистиллированной водой.
2. Перенести бутоны на стерильную поверхность стола ламинар-бокса, осторожно отделить пыльцевые мешки от тычиночных нитей.
3. Стерильной препарировальной иглой перенести пыльники на поверхность питательною среды в пробирки по 5-10 пыльников в каждую.
4. Закрыть пробирки и перенести в термостат с температурою 26 °Cи влажностью 70 %.
5. Результаты работы зарисовать через 2–4 недели.
Работа 2. ПОЛУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ ПЫЛЬЦЕВЫХ КАЛЛУСОВ ВИШНИ.
Объяснение. Способность каллусов к морфогенезу определяется балансом фитогормонов как в питатальных средах, так и в самих клетках (эндогенные фитогормоны). Для получения растений-регенерантов используют среды, содержащие кинетин — 0,1–0,3 мг/л, ГК — 4 мг/л, 6-БАП — 0,5–1,5 мг/л, ИУК — 0,5–1,5 мг/л. Каллусы культивируют при 16 часовом фотопериоде и интенсивностью освещения 2–3 kLx.
Морфогенный каллус имеет плотную консистенцию, бугристую поверхность, мо лочно-белый, желтоватый и зеленоватый цвет.
Поверхностные слои морфогенного каллуса состоят из меристематических, богатых цитоплазмою клеток, имеющих заполненные крахмалом пластиды и хорошо развитые митохондрии. Центральная часть каллуса представлена крупными вакуолизированными клетками с пикнотическими ядрами, которые чередуются с меристематическими участками.
Для индукции побегообразования, каллусы переносят на среды для регенерации: МС + кинетин — 1–2 мг/л, 6-БАП — 3–6 мг/л, аденин — 1–2 мг/л, ГК — 1–2 мг/л, феруловая кислота — 0,5–0,7 мг/л, ИУК — 0,2–0,4 мг/л, НУК — 0,2–0,4 мг/л, ИМК — 0,2–0,4 мг/л, 2,4-Д — 0,1–0,3 мг/л.
Через 1,5–2 месяца культивирования морфогенных каллусов на 16-ти часовом фотопериоде при освещенности 3 kLx начинается пролиферация почек и побегов. Морфогенные каллусы пассируют каждые 4–6 недель.
Побеги-регенеранты, полученные из пыльцевых каллусов, неоднородны по морфологическим признакам. Это обусловлено гетерогенностью каллусов. Поэтому необходимо проводить цитологическое изучение и каллусов и растений-регенерантов.
Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом, пробирки с пыльцевыми каллусами, пробирки со средами для получения морфогенного каллуса, пробирки со средами для регенерации, препарировальные иглы, пинцеты.
Ход работы.
1. В условиях ламинар-бокса извлечь каллус из пробирки и перенести на стерильную поверхность. Стерильной препарировальной иглой выделить зону морфогенного каллуса (белые мелкие клетки, каллус средней плотности).
2. Стерильной препарировальной иглой перенести кусочек (5–6 мм) морфоген ного каллуса в пробирку со средой для регенерации, закрыть пробирку стерильной пробкой.
3. Перенести штативы с пробирками в световую культуральную комнату с температурой 25 + 2 °C, влажностью 70 %, освещенностью 4 kLx.
4. Через 4–6 недель зарисовать результаты работы.
5. Побеги перенести в пробирки со средами для пролиферации побегов: МС +1–2 мг/л 6-ЕАП, 1 мг/л НУК.
6. Перенести побеги на среды для индукции корнеобразования: МС без гормонов, МС +1–2 мг/л ИМК + 1 мг/л ГК и поместить на 20 дней в темноту.
ТЕРМИНОЛОГИЯ
In vitro — выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах, в асептических условиях.
Тотипотентность — свойство соматических клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма.
Омнипотентность ядер — сохранение ядрами соматических клеток растений всех потенций ядра зиготы, то есть сохранение всей генетической информации.
Культура тканей in vitro — выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов растений.
Культура органов in vitro — асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней, стеблевых апексов, незрелых частей цветка, незрелых плодов.
Культура корней in vitro — асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней.
Культура меристем in vitro — асептическое выращивание на искусственной питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примордиями.
Культура суспензионная или культура клеток in vitro — асептическое выращивание отдельных клеток или их небольших групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде.
Культура зиготических зародышей in vitro — асептическое выращивание на искусственной питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей.
Апекс — верхушечная часть стебля или корня.
Меристема — образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клетками.
Апикальное доминирование — явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной почки.
Адвентивные почки — почки, возникшие из тканей и клеток растения, обычно их не образующих.
Фитогормоны — (гормоны растений) — биолигически активные соединения, образующиеся в растениях в малых количествах, вызывающие специфический ростовой или формообразовательный эффект.
Ауксины — фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие ррост стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков.
Цитокинины — фитогормоны (кинетин, 6-ЕАП), активизирующие развитие
